loxP site Cre 재조합 효율 측정

본 연구에서는 기존 벡터 pRGA와 pRGB를 기반으로 새로운 벡터 pFGB를 제작했습니다. pRGA를 주형으로 하여 β-galactosidase 유전자의 일부분(6번째-56번째 아미노산)을 PCR을 이용하여 증폭했습니다. 증폭된 PCR 산물(약 200bp)은 Spe I과 Mlu I 제한효소로 처리하여 pRGB 벡터(5.1kb)에 연결(ligation)하여 pFGB 벡터를 완성했습니다. β-galactosidase 유전자의 reading frame을 정확히 맞추기 위해 Spe I 부위 상류에 CC 염기 두 개를 추가했습니다. 이렇게 제작된 pFGB 벡터는 두 개의 lox site 사이에 β-galactosidase 유전자의 일부를 포함하고 있습니다. lox site 간의 Cre-매개 재조합이 일어나면, 원래 분리되어 있던 β-galactosidase 유전자의 단편들이 연결되어 기능성 β-galactosidase를 생성하게 되고, 이는 X-gal 염색을 통해 청색 콜로니로 확인 가능합니다. 따라서, 청색 콜로니의 수는 Cre/lox 재조합의 효율을 직접적으로 나타내는 지표로 사용됩니다. 이 과정에서 사용된 PCR primer는 Spe I과 Mlu I 제한효소 절단 부위를 포함하도록 디자인되어, 효율적인 벡터 제작과 유전자 삽입을 가능하게 합니다.

본 연구에서 사용된 β-galactosidase는 특이적인 성질을 가지고 있습니다. 5번째와 6번째 아미노산이 약 400bp 정도 떨어져 있어도 활성을 유지하는 특징이 있습니다. 완성된 pFGB 벡터는 S2C11 VH gene과 3D8 VL gene 사이에 loxP 511, 그리고 3D8 VL gene 하류에는 g3p와 E-tag 유전자가 위치합니다. E-tag과 β-galactosidase 유전자 사이에는 loxP wt가 위치하며, 두 lox site 사이에서 Cre-매개 재조합이 일어나면 β-galactosidase 유전자의 5번째와 6번째 아미노산 간의 거리가 가까워집니다. 비록 VH 유전자(약 400bp)가 그 사이에 존재하지만, β-galactosidase의 특성 때문에 유전자의 기능은 유지됩니다. 따라서 재조합이 일어날 경우 X-gal 염색을 통해 청색 콜로니가 관찰되며, 전체 콜로니 대비 청색 콜로니의 비율을 계산하여 Cre-매개 재조합 효율을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이 시스템은 lox site 간의 재조합 여부를 간편하고 효율적으로 확인하는 방법을 제공합니다.

본 연구에서는 Cre 재조합효소를 발현하는 BS1365 박테리아를 이용하여 in vivo Cre/lox 재조합 효율을 측정했습니다. 다양한 lox site 조합 (lox wt, M2, M3, M7, M11, lox 2272, lox 5171 등)을 포함하는 pFGB 벡터를 BS1365 competent cell에 형질전환했습니다. 얼음에서 1시간 동안 정치한 후, 37℃에서 90초간 heat shock 처리하고, 37℃ 배양기에서 250 rpm으로 20-30분간 배양했습니다. 형질전환된 박테리아는 kanamycin (50 ㎍/㎖)과 ampicillin (100 ㎍/㎖)이 포함된 LB 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양했습니다. 이 과정을 통해 BS1365 박테리아 내에서 Cre-매개 재조합 반응이 일어나도록 유도하였습니다. 하룻밤 배양 후, 각 콜로니에서 plasmid DNA를 추출하는 과정은 LaboPass™ Mini-prep kit를 사용하여 진행했습니다. 이렇게 추출된 plasmid DNA는 후속 실험인 JM109 박테리아 형질전환에 사용되었습니다. BS1365 박테리아는 Cre recombinase를 발현하여 lox site 사이의 재조합을 유도하는 역할을 수행하며, 본 연구에서 사용된 형질전환 및 배양 조건은 최적의 재조합 효율을 얻기 위해 설정되었습니다.

BS1365 박테리아로부터 추출된 plasmid DNA는 α-complementation이 가능한 JM109 박테리아에 형질전환되었습니다. 형질전환된 JM109 박테리아는 ampicillin, X-gal, IPTG가 포함된 LB agar plate에 도말하여 배양하였습니다. 배양 후, 전체 콜로니 수와 청색 콜로니 수를 계산하여 재조합 효율을 산출했습니다. 재조합 효율은 (청색 콜로니 수 / 전체 콜로니 수) × 100으로 계산되었습니다. 청색 콜로니는 β-galactosidase 유전자의 활성을 나타내며, 이는 lox site 간의 재조합이 성공적으로 일어났음을 의미합니다. JM109 박테리아는 α-complementation을 통해 β-galactosidase 유전자의 활성을 검출하는 데 사용되며, 이를 통해 재조합 효율을 간편하게 정량적으로 분석할 수 있습니다. 본 연구에서는 다양한 lox site 조합에 따른 재조합 효율을 비교 분석하여, lox site의 서열이 재조합 효율에 미치는 영향을 정확하게 평가했습니다. 특히, 특정 lox site 조합에서 1% 미만의 낮은 재조합 효율을 확인하여 이러한 조합이 incompatible lox site임을 제시했습니다.

BS1365 박테리아에서 재조합 반응을 유도한 후, 추출된 plasmid DNA는 Nco I 제한효소로 처리되었습니다. Nco I 처리 후, DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 분석되었습니다. Cre-매개 재조합이 성공적으로 일어났다면, 두 lox site 사이에 위치한 DNA 단편이 제거되어 DNA 크기의 변화가 관찰됩니다. 본 연구에서는 재조합으로 인해 두 lox site 사이의 DNA 단편이 결실되었는지 확인하기 위해 이 방법을 사용했습니다. Nco I 제한효소는 특정 염기서열을 인식하여 DNA를 절단하는 역할을 수행하며, 전기영동을 통해 크기가 다른 DNA 단편을 분리하여 재조합의 성공 여부를 확인하는 데 사용됩니다. 이 결과는 X-gal 염색을 통한 청색 콜로니 관찰 결과와 함께 재조합 효율을 더욱 정확하게 검증하는 데 사용되었습니다. 이를 통해 Cre-lox system을 이용한 유전자 조작의 정확성을 높일 수 있었습니다.

본 연구에서는 정제된 Cre 재조합효소를 이용하여 in vitro에서 Cre/lox 재조합 효율을 측정했습니다. pFGB-wt/wt 벡터 (250 ng)에 Cre 재조합효소를 다양한 농도 (0.5 U, 1 U, 2 U, 4 U)로 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰습니다. 반응 완충용액 (33 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5)과 증류수를 사용하여 최종 반응액의 부피를 50㎕로 맞추었습니다. 반응 후, 70℃에서 10분간 열처리하여 Cre 재조합효소를 불활성화시켰습니다. 다양한 mutant lox site 조합 (pFGB-mutant/wt, pFGB-mutant/mutant)을 포함하는 벡터들도 동일한 방법으로 처리하였습니다. Cre 재조합효소의 양에 따른 재조합 효율 변화는 agarose gel 전기영동과 X-gal 염색을 통해 분석하였습니다. Gel 전기영동에서는 재조합으로 인해 생성된 3.4 kb DNA 단편의 밴드 강도를 관찰하여 재조합 효율을 추정했습니다. X-gal 염색에서는 청색 콜로니의 수를 측정하여 재조합 효율을 정량적으로 분석했습니다. 이러한 in vitro 실험은 Cre 재조합효소의 활성과 lox site의 서열 특이성을 분리하여 분석하는 데 중요한 역할을 합니다.

Cre 재조합효소의 양에 따른 재조합 효율 변화를 관찰하기 위해, 다양한 양의 Cre 재조합효소 (0.5 U, 1 U, 2 U, 4 U)를 사용하여 실험을 진행했습니다. Gel 전기영동 결과, Cre 재조합효소의 양이 증가함에 따라 3.4 kb band의 강도가 증가하는 것을 확인하였습니다. 이는 Cre 재조합효소의 양이 증가할수록 재조합 효율이 높아짐을 시사합니다. X-gal 염색 결과 또한 Cre 재조합효소의 양이 증가함에 따라 재조합 효율이 증가하는 경향을 보였습니다. 반면, 반응 시간을 1시간, 2시간, 4시간, 8시간으로 변화시키면서 실험을 진행했지만, 반응 시간의 증가에 따른 재조합 효율의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 Cre 재조합효소의 농도가 in vitro 재조합 효율에 중요한 영향을 미치지만, 반응 시간은 특정 범위 내에서는 효율에 큰 영향을 미치지 않음을 보여줍니다. 본 연구는 Cre 재조합효소의 최적 농도를 설정하는 데 중요한 정보를 제공하며, in vitro 재조합 시스템의 효율을 높이기 위한 추가 연구의 방향을 제시합니다.

in vitro 재조합 반응 후, 재조합이 유도된 DNA는 JM109 박테리아에 형질전환되었습니다. 형질전환된 박테리아는 nitrocellulose membrane으로 덮인 SOBAG 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양했습니다. 이 과정은 in vivo 실험과 유사하게 β-galactosidase 유전자의 발현을 통해 재조합 여부를 확인하는 데 사용되었습니다. SOBAG 배지와 nitrocellulose membrane은 박테리아 배양과 β-galactosidase 활성 측정을 위한 최적의 조건을 제공합니다. 본 연구에서는 in vitro 재조합 효율을 측정하기 위해 JM109 박테리아 형질전환 및 SOBAG 배지를 이용한 방법을 사용하여, 다양한 mutant lox site 조합의 재조합 효율을 비교 분석했습니다. 하지만 in vitro 실험에서는 전반적으로 낮은 재조합 효율을 보였으며, 그 원인에 대한 추가적인 연구가 필요함을 시사합니다.

본 연구는 Cre/lox 재조합 시스템을 이용한 유전자 조작 기술의 효율 향상을 목표로 진행되었습니다. 기존 연구에서는 lox wt와 mutant lox site 간의 비특이적 재조합으로 인해 유전자 조작 효율이 저하되는 문제점이 있었습니다. 본 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위해, 서로 다른 염기서열을 갖는 incompatible lox site들을 이용하여 단일 재조합 시스템에서 재조합 효율을 측정하고, 그 결과를 기반으로 유전자 조작 시스템의 활용 범위를 넓히고자 하였습니다. 특히, lox wt, lox 2272, lox 5171, 그리고 lox wt, M3, M7, lox 5171 등의 조합에서 1% 미만의 낮은 재조합 효율을 확인하여, 이러한 incompatible lox site들을 이용한 유전자 염색체내 통합, 유전자 교체 및 결실 등의 유전자 조작 연구가 앞으로 더욱 활발하게 진행되어야 함을 시사합니다. 본 연구에서 개발된 단일 재조합 효율 측정 시스템은 다양한 유전자 조작 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대됩니다.

Cre를 발현하는 BS1365 박테리아를 이용한 in vivo 실험에서는 대부분의 동일한 lox site 조합에서 100%에 가까운 높은 재조합 효율을 나타냈습니다. 다만 M3/M3 조합은 46%의 상대적으로 낮은 효율을 보였는데, 이는 기존 연구 (Stephen 등, 2002)에서 보고된 90% 이상의 효율과 차이를 보입니다. 이러한 차이는 Southern blot과 같은 다른 측정 시스템의 단점이나, 사용된 Cre 발현 박테리아의 차이 등이 원인일 수 있습니다. 반면, in vitro 실험에서는 전반적으로 낮은 재조합 효율이 관찰되었습니다. 실험 조건 최적화에도 불구하고 낮은 효율을 개선하지 못했으며, 그 원인은 추가 연구를 통해 밝혀져야 합니다. in vivo와 in vitro 실험 결과의 차이는 Cre 재조합효소의 활성, lox site의 접근성, 실험 시스템의 차이 등 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 향후 Cre 재조합효소의 활성을 증대시키는 연구를 통해 in vitro 재조합 효율을 in vivo 수준으로 향상시킬 수 있다면, Cre/lox 재조합 시스템을 이용한 유전자 조작 연구의 편의성이 크게 증가할 것입니다.

본 연구에서는 in vivo 실험을 통해 lox wt, lox 2272, lox 5171 및 lox wt, M3, M7, lox 5171 조합이 1% 미만의 재조합 효율을 나타내는 incompatible lox site임을 확인하였습니다. 이는 기존의 Cre/lox 재조합 시스템에서 단 두 개의 lox site만 사용 가능했던 한계를 극복하고, 여러 개의 incompatible lox site를 동시에 사용할 수 있는 가능성을 제시합니다. M2, M3, M7, M11, lox 2272, lox 5171 등 다양한 mutant lox site에 대한 재조합 효율 측정 결과는 유전자 조작 시스템의 활용 범위를 넓히는 데 중요한 기초 자료를 제공합니다. 특히, 서로 다른 incompatible lox site 조합을 이용하여 복잡한 유전자 조작을 설계하고 수행하는 연구가 향후 더욱 활발히 진행될 것으로 예상됩니다. 이는 유전체 편집 기술의 정확성과 효율성을 향상시키고, 다양한 생명과학 연구 분야에 널리 응용될 수 있을 것으로 기대됩니다.