NF1 악성화 유전자 발굴 및 기능규명

본 연구는 신경섬유종증 1형(Neurofibromatosis type 1, NF1)의 악성화 기전을 규명하기 위한 기초 연구입니다. NF1은 상염색체 우성 유전질환으로, 다기관 신경계 종양 형성을 특징으로 하며 높은 발병률과 예측 불가능한 합병증, 효과적인 치료법 부재 등으로 인해 근본적인 치료법 개발을 위한 연구가 시급합니다. NF1 유전자의 돌연변이에 의한 neurofibromin 결핍과 Ras 단백질의 과잉 활성이 발병 기전으로 알려져 있으나, 동일한 유전형을 가진 세포에서도 정상, 양성, 악성으로 다르게 변화하는 현상으로 미루어 볼 때, NF1 악성화에 관여하는 추가적인 유전자의 존재가 예상됩니다. 따라서 본 연구는 NF1 악성화에 관여하는 유전자를 발굴하고 그 기능을 규명하여 NF1의 병인 기전 이해와 효과적인 치료법 개발에 기여하고자 합니다. 현재 국내 NF1 관련 연구의 부족함 또한 연구의 필요성을 강조하는 부분입니다. 이를 위해, 정상, 양성, 악성 조직 세포에서의 유전자 발현 차이를 비교 분석하여 NF1 악성화에 중요한 역할을 하는 유전자를 찾아낼 계획입니다.

본 연구에서는 NF1 환자의 정상 피부 조직, 양성 종양 조직, 악성 종양 조직으로부터 섬유아세포(fibroblasts)를 분리 배양하여 연구를 진행하였습니다. 먼저, Comparative Genomic Hybridization (CGH) array 분석을 통해 전 유전체 수준에서의 유전적 변이(genetic alteration)를 확인하고자 하였으나, 정상, 양성, 악성 세포 모두에서 유의미한 변화를 발견하지 못했습니다. 이후, Annealing Controlled Primer (ACP) 기반의 RT-PCR과 Western blotting을 이용한 DEG (Differentially Expressed Gene) screening을 통해 정상, 양성, 악성 세포 간 유전자 발현 차이를 분석했습니다. 총 64개의 DEGs가 발굴되었으며, 발현 차이가 뚜렷한 20개의 유전자를 추가적으로 cloning 및 염기서열 분석을 통해 동정했습니다. 이 중 NF1 악성화와의 연관성이 높다고 판단되는 8개 유전자를 선정하여 RT-PCR 및 Western blotting을 통해 검증하였습니다. 또한, 악성 세포에서 발현이 증가하는 TAGLN과 SERPINE1 유전자에 대한 RNA interference (RNAi)를 통해 유전자 발현 억제 효과를 확인하였고, 악성 세포에서 발현이 감소하는 IFITM1 유전자의 과발현(overexpression)을 유도하여 NF1 악성화 과정에서의 기능을 규명했습니다.

DEG screening 결과, NF1 악성화와 관련된 세 가지 후보 유전자(candidate genes)를 최종적으로 선정하였습니다. TAGLN과 SERPINE1은 악성 세포에서 발현이 증가하는 유전자이며, IFITM1은 악성 세포에서 발현이 감소하는 유전자입니다. RNAi를 이용한 TAGLN과 SERPINE1의 발현 억제 실험과 IFITM1의 과발현 실험 결과, 모든 경우에서 악성 NF1 세포의 증식률(proliferation rate)이 감소하였습니다. 특히 IFITM1의 과발현은 양성 및 악성 NF1 세포 모두에서 미토콘드리아 파편화(mitochondria fragmentation)를 유도하였고, 악성 세포에서 특이적인 세포 사멸을 유도하는 것을 확인했습니다. 본 연구에서 사용된 CGH array 분석에서는 유전체 변이(genetic alteration)가 발견되지 않았습니다. 다만, Western blotting 분석에서는 일부 항체의 특이성 문제로 인해 단백질 수준의 발현 변화를 정확하게 확인하는 데 어려움이 있었습니다. 2004년 12월 아주대학교병원에서 NF1 수술을 받은 24세 남성 환자의 종양 조직(정상, 양성, 악성)이 본 연구에 사용되었습니다. Macrogen의 BAC-mediated array CGH microarray 서비스를 이용하였습니다. (주)Geneall biotechnology의 gel extraction kit, Qiagen의 DNA 추출 키트, Invitrogen의 RNA 추출 키트 등이 사용되었습니다.

연구진은 NF1 환자 유래 정상, 양성, 악성 세포에서 유전자 발현 차이를 분석하기 위해 차등 발현 유전자(DEG) 스크리닝을 실시했습니다. Annealing Controlled Primer (ACP) 기반의 RT-PCR 및 Western blotting 기법을 이용하여 mRNA 및 단백질 수준에서의 발현량 차이를 정밀하게 분석했습니다. 이를 통해 정상, 양성, 악성 조직에서 발현 패턴이 서로 다른 유전자들을 식별하고, NF1 악성화 과정에 연관된 유전자들을 찾고자 하였습니다. 총 64개의 차등 발현 유전자(DEGs)가 발굴되었으며, 그 중 발현량 차이가 가장 큰 상위 20개의 유전자를 후보 유전자로 선정했습니다. 후보 유전자 선정 기준에는 기존 연구에서 밝혀진 종양 발생(tumorigenesis)과의 연관성, 양성 세포 대비 악성 세포에서의 발현량 차이 등이 고려되었습니다. 세포 악성화 이후의 2차적 변화로 인한 당연한 발현량 변화는 제외되었습니다. 전체 유전체 수준의 유전적 변이(genetic alteration)를 확인하기 위해 Comparative Genomic Hybridization (CGH) array 분석을 병행하였으나, 세포주 모두에서 특정 유전자의 증폭이나 소실은 관찰되지 않았습니다.

스크리닝 과정을 통해 선별된 20개의 후보 유전자 중, 알려진 유전자 16개에 대해 cloning과 염기서열 분석을 실시하여 유전자를 동정했습니다. 이 중 NF1 악성화와의 관련성이 높다고 판단되는 8개의 유전자를 선정하여 RT-PCR과 Western blotting을 이용한 추가적인 검증을 진행했습니다. 유전자 선정 기준은 종양 발생과의 관련성, 양성 세포 대비 악성 세포에서의 발현량 증가 또는 감소 여부를 고려하였으며, 악성화 과정의 2차적 변화로 인한 당연한 발현 변화는 배제하였습니다. 최종적으로 선정된 8개 유전자는 종양 세포에서 발현량이 점차 증가하는 DYNLL1, 양성 및 악성 세포 모두에서 발현량이 증가하는 TAGLN, 악성 세포에서만 발현량이 증가하는 ENC1, weakly similar RDX, SERPINE1, 그리고 악성 세포에서 발현량이 점차 감소하는 IFITM1과 ATP2A2입니다. RT-PCR 및 Western blotting 결과, DEG screening 결과와 일치하지 않는 DYNLL1을 제외하고, IFITM1, DHRS3, ATP2A2는 정상, 양성, 악성 세포에서 발현량이 점차 감소하는 패턴을 보여 DEG screening 결과와 일치했습니다.

상기 검증 과정을 거쳐, 최종적으로 NF1 악성화와 관련된 세 가지 핵심 유전자를 선정했습니다. 악성화된 NF1 세포에서 발현량이 증가하는 유전자는 TAGLN과 SERPINE1이며, 발현량이 감소하는 유전자는 IFITM1입니다. 이러한 결과는 이들 유전자가 NF1 악성화 기전에 중요한 역할을 할 가능성을 시사합니다. 이후 연구에서는 이들 유전자의 기능 규명을 위해 유전자 발현 조절 시스템을 이용하여 악성화된 NF1 세포에서의 기능적 역할을 추가적으로 분석할 예정입니다. 선정된 유전자들은 NF1 악성화의 새로운 치료 표적을 제시할 수 있는 중요한 후보 유전자로 간주됩니다.

악성 NF1 세포에서 발현이 증가하는 TAGLN과 SERPINE1 유전자의 기능을 규명하기 위해 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 기법을 적용했습니다. human U6 promoter를 사용하고, hairpin 구조를 가진 유전자 특이적 염기서열을 포함하는 shRNA(short hairpin RNA)를 pREP4 벡터에 cloning하여 RNAi construct를 제작했습니다. TAGLN과 SERPINE1 각각에 대해 5개씩, 총 10개의 shRNA construct를 제작하였으며, 대조군(control)으로는 human에 존재하지 않는 GFP(green fluorescence protein)에 대한 RNAi를 사용했습니다. 제작된 RNAi constructs를 NF1 세포(정상 및 악성)에 transfection하여 단백질 발현량 변화를 Western blotting을 통해 분석했습니다. HeLa 세포에서의 사전 실험을 통해 효과적인 shRNA construct (T#1, T#2, T#5)를 선별하고, NF1 세포에 적용하여 TAGLN과 SERPINE1의 발현 억제 효과를 확인했습니다. RNAi 적용 후 NF1 세포의 증식률을 측정하여 유전자 발현 억제와 세포 증식 간의 상관관계를 분석했습니다. 실험 결과, RNAi 적용으로 NF1 악성 세포의 증식률이 감소하는 것을 확인했습니다. 이는 TAGLN과 SERPINE1의 발현 억제가 NF1 악성화 억제에 기여할 수 있음을 시사하는 결과입니다.

악성 NF1 세포에서 발현이 감소하는 IFITM1 유전자의 기능을 규명하기 위해, IFITM1 유전자를 세포 내에서 과발현(overexpression)시키는 실험을 수행했습니다. 먼저, cDNA를 주형으로 하여 XhoI, BamHI 제한효소를 사용하여 human IFITM1 유전자를 cloning하고, pREP4 벡터에 삽입하여 overexpression construct를 제작했습니다. 이 construct를 HT1080 (human N-Ras activated epithelial fibrosarcoma) 및 T24 (human H-Ras activated epithelial sarcoma) 세포주에 transfection하고, Western blotting을 통해 IFITM1 단백질의 발현을 확인하고 세포 증식률을 측정했습니다. HT1080 세포에서는 대조군에 비해 증식률이 증가한 반면, T24 세포에서는 감소하는 결과를 보였습니다. 같은 방법으로 NF1 세포 (정상 및 악성)에 IFITM1 overexpression construct를 적용하여 Western blotting과 세포 증식률 측정을 실시했습니다. NF1 정상 세포에서는 증식률이 변화가 크게 나타나지 않았으나, 악성 세포에서는 증식률이 감소하였으며, 특히 미토콘드리아 파편화(mitochondria fragmentation)와 악성 세포 특이적 세포 사멸이 관찰되었습니다. 이는 IFITM1의 과발현이 NF1 악성화 억제에 관여할 수 있음을 나타냅니다. 하지만, 항체의 특이성 문제로 인해 단백질 수준의 발현 변화를 명확하게 확인하지 못한 제한점이 존재했습니다.

본 연구는 신경섬유종증 1형(NF1)의 악성화 과정에 대한 이해를 높이고자, NF1 환자 유래 세포 (정상, 양성, 악성)에서의 유전자 발현 차이를 분석하여 NF1 악성화와 관련된 유전자들을 규명하는 데 초점을 맞추었습니다. 연구 결과, 악성 NF1 세포에서 발현이 증가하는 TAGLN과 SERPINE1, 그리고 발현이 감소하는 IFITM1 유전자를 NF1 악성화의 주요 후보 유전자로 확인하였습니다. 이는 RNA 간섭(RNAi) 및 유전자 과발현 실험을 통해 확인된 결과입니다. 특히 IFITM1의 과발현은 미토콘드리아 파편화와 악성 세포 특이적 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났습니다. TAGLN과 SERPINE1에 대한 RNAi 적용은 악성 세포의 증식을 억제하는 효과를 보였습니다. 이러한 결과는 TAGLN, SERPINE1, IFITM1 유전자가 NF1의 악성화 과정에 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사합니다. 하지만, 일부 Western blotting 실험에서는 항체의 특이성 문제로 인해 단백질 수준의 발현 변화를 명확하게 확인하지 못한 제한점이 있습니다.

본 연구는 NF1 악성화 기전에 대한 새로운 이해를 제공하고, TAGLN, SERPINE1, IFITM1 유전자를 NF1 악성화 치료를 위한 새로운 표적으로 제시하는 데 중요한 의미를 가집니다. 특히, IFITM1의 악성화 억제 효과는 향후 NF1 악성화 치료제 개발을 위한 새로운 전략을 제시할 수 있습니다. 하지만, 본 연구는 단일 환자의 조직 샘플을 사용한 제한적인 연구라는 점과, 일부 항체의 특이성 문제로 인해 Western blotting 결과의 정확도가 다소 낮았다는 점을 한계점으로 제시할 수 있습니다. 또한, in vivo 연구를 통한 결과 검증이 부족하다는 점도 한계로 지적할 수 있습니다. 후속 연구에서는 더 많은 환자 샘플을 확보하고, 다양한 실험 기법을 활용하여 본 연구 결과를 더욱 폭넓게 검증할 필요가 있습니다.

향후 연구는 다음과 같은 방향으로 진행될 수 있습니다. 첫째, 본 연구에서 제시된 세 가지 후보 유전자(TAGLN, SERPINE1, IFITM1)의 기능을 더욱 심도 있게 규명하는 연구가 필요합니다. IFITM1의 미토콘드리아 파편화 및 세포 사멸 유도 기전에 대한 분자 수준의 분석이 필요하며, TAGLN과 SERPINE1의 기능과 악성화 과정과의 연관성에 대한 추가 연구가 수행되어야 합니다. 둘째, 본 연구의 결과를 동물 모델을 이용한 in vivo 연구를 통해 검증할 필요가 있습니다. 이는 본 연구에서 도출된 결과의 임상적 적용 가능성을 평가하는 데 중요한 단계가 될 것입니다. 셋째, 본 연구에서 확인된 유전자들을 표적으로 하는 새로운 NF1 악성화 치료제 개발 연구가 진행되어야 합니다. 이를 통해 NF1 환자의 삶의 질을 개선하는 데 기여할 수 있을 것입니다. 마지막으로, 더욱 다양한 환자군과 샘플을 이용한 연구를 통해 얻어진 결과의 일반화 가능성을 높이는 것이 중요합니다.