Deferoxamine 유도 세포노화 및 거대 미토콘드리아 형성 기전 연구

연구는 세포가 필요로 하는 에너지의 대부분을 생산하는 역동적인 세포내 소기관인 미토콘드리아의 형태 변화에 초점을 맞춥니다. 특히, 세포 노화 과정에서 나타나는 거대 미토콘드리아 형성에 대한 기전을 규명하고자 합니다. 미토콘드리아는 환경 변화에 따라 모양, 이동성, 수량이 변하는 특징을 가지며, 노화 과정에서 기능 이상이 동반되는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 기능 이상과 미토콘드리아 형태 변화, 특히 거대 미토콘드리아 형성 간의 상관관계를 규명하는 것이 연구의 주요 목표입니다. 본 연구에서는 철 이온 흡착제인 Deferoxamine (DFO)를 이용하여 세포 노화를 유도하고, 이 과정에서 나타나는 거대 미토콘드리아 형성 과정과 관련된 미토콘드리아 기능 이상을 조사합니다. 또한, 미토콘드리아 형태 조절 인자로 알려진 Drp1과 Mfn이 이 과정에서 어떻게 작용하는지를 분석하여 세포 노화 중 나타나는 거대 미토콘드리아 형성 기전을 이해하고자 합니다. 기존 연구에서 노화된 조직에서 거대 미토콘드리아가 관찰되었다는 보고가 있지만, 노화 과정 동안 미토콘드리아 기능 저하와 형태학적 변화 간의 상관관계를 명확히 밝힌 연구는 부족한 실정입니다. 따라서 본 연구는 이러한 상관관계를 규명하기 위한 적절한 세포 모델 체계를 구축하고, 거대 미토콘드리아 형성 기전에 대한 심층적인 이해를 제공하고자 합니다.

본 연구에서는 Deferoxamine (DFO)과 Hydrogen peroxide (H₂O₂)를 이용하여 세포 노화를 유도하는 다양한 모델을 사용했습니다. DFO는 철 이온 흡착제로서, 세포 노화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, H₂O₂는 활성산소의 대표적인 예시로 세포 손상 및 노화를 유발합니다. 또한, 미토콘드리아 DNA의 손상을 유도하기 위해 Ethidium Bromide (EtBr)를 사용하고, 미토콘드리아 DNA가 완전히 제거된 ρ0 세포를 이용하여 미토콘드리아 DNA의 역할을 조사했습니다. 세포 배양에는 사람 정상 간세포주인 Chang 세포와 primary human diploid fibroblast (HDF) 세포를 사용했습니다. HDF 세포는 young (PD 30, doubling time 24시간)과 old (PD 91, doubling time 14일) 세포로 구분하여 사용하여 세포 노화에 따른 미토콘드리아 형태 변화를 비교 분석했습니다. 미토콘드리아 형태 관찰에는 MitoTracker Red 염색과 전자 현미경 분석을 활용하였습니다. 미토콘드리아 DNA 양 측정에는 conventional genomic PCR을 사용했고, 단백질 발현 분석에는 Western blotting을 실시했습니다. Western blotting 분석에는 Drp1, Mfn1, Mfn2 등 미토콘드리아 형태 조절 단백질에 대한 항체와 GSK3β, 인산화 관련 항체 등을 사용하여 단백질 발현량 및 인산화 상태를 분석했습니다. 또한, Drp1의 인산화 및 GSK3β와의 상호작용을 확인하기 위해 면역침전법(immunoprecipitation)을 사용하였습니다. 특히, Mfn1과 Mfn2 항체는 Dr. Manuel Rojo (Institut de Myologie, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris) 그룹으로부터 제공받았습니다. 실험에 사용된 시약 및 기기 정보는 본문에 상세히 기재되어 있습니다.

Chang 세포에 대한 H₂O₂ 처리 결과, 고농도(1mM)에서는 미토콘드리아가 핵 주변으로 모이며 fragmentation이 발생하고 내막이 소실되어 세포 사멸이 유도되었습니다. 반면, 저농도(200μM) H₂O₂ 처리 시에는 세포 노화가 유도되면서 길어지거나 커진 거대 미토콘드리아 형성이 관찰되었습니다. Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) assay 결과를 통해 저농도 H₂O₂ 처리에 의한 세포 노화가 확인되었습니다. 전자 현미경 관찰을 통해 저농도 H₂O₂ 처리 시 미토콘드리아의 길이 또는 크기 증가가 명확하게 나타났습니다. 이는 특정 농도의 활성산소가 거대 미토콘드리아 형성에 직접적으로 관여함을 시사하는 결과입니다. 고농도 H₂O₂ 처리에서 나타난 미토콘드리아 fragmentation은 기존 연구에서 세포 사멸 시 관찰되는 현상과 일치합니다. 즉, 활성산소의 농도에 따라 미토콘드리아의 반응이 다르게 나타나는 것을 확인했습니다. 저농도는 거대 미토콘드리아 형성으로, 고농도는 미토콘드리아의 심각한 손상 및 세포 사멸로 이어졌습니다. 이러한 결과는 세포 노화 과정에서 활성산소의 역할을 이해하는 데 중요한 실마리를 제공합니다.

Complex II 억제제인 TTFA를 Chang 세포에 처리했을 때, 거대 미토콘드리아 형성은 관찰되지 않았고, 오히려 미토콘드리아의 fragmentation이 관찰되었습니다. TTFA를 200, 400, 600, 800μM 등 다양한 농도로 처리했을 때에도, 그리고 고농도 glucose 배지에서도 동일한 결과가 나타났습니다. 이 결과는 Complex II의 기능 저하만으로는 거대 미토콘드리아 형성이 유도되지 않으며, 오히려 미토콘드리아의 기능 저하가 미토콘드리아 fragmentation으로 이어질 수 있음을 보여줍니다. 이는 Complex II의 기능 저하가 거대 미토콘드리아 형성의 직접적인 원인은 아님을 시사합니다. 세포 내 에너지 수준과 무관하게 미토콘드리아 fragmentation이 발생한다는 점도 주목할 만합니다. 하지만 TTFA에 의한 미토콘드리아 fragmentation의 정확한 기전은 추가 연구가 필요한 부분입니다.

미토콘드리아 DNA 복제 억제제인 EtBr을 처리하여 미토콘드리아 DNA에 손상을 유도하거나, 미토콘드리아 DNA를 완전히 제거한 ρ0 세포에서 미토콘드리아 형태를 관찰한 결과, 거대 미토콘드리아 형성은 관찰되지 않았습니다. 대신, 미토콘드리아의 내막 구조인 cristae 구조의 비정상적인 변화만이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 미토콘드리아 DNA 손상이 거대 미토콘드리아 형성의 직접적인 원인은 아니라는 것을 시사합니다. 관찰된 ρ0 세포의 미토콘드리아 형태는 기존 연구에서 보고된 다른 ρ0 세포주에서의 미토콘드리아 형태와 일치하여 결과의 신뢰성을 높였습니다. 결론적으로, 미토콘드리아 DNA의 손상은 미토콘드리아 내막 구조의 변형을 유발하지만 거대 미토콘드리아 형성과는 직접적인 연관성이 적다는 것을 알 수 있었습니다. 이는 거대 미토콘드리아 형성의 기전이 미토콘드리아 DNA보다는 다른 요인에 의해 매개될 가능성이 높음을 의미합니다.

DFO 및 H₂O₂를 이용한 세포 노화 모델 외에도, primary human diploid fibroblast (HDF) 세포의 지속적인 계대 배양을 통해 노화를 유도한 old HDF 세포에서도 거대 미토콘드리아가 관찰되었습니다. 또한, 기존 연구에서 TGF-β1 또는 H₂O₂ 처리에 의해 세포 노화가 유도된 Mv1Lu 세포에서도 거대 미토콘드리아 형성이 확인되었습니다. 특히, 모든 세포 노화 모델에서 활성산소 생성의 증가가 공통적으로 관찰되었다는 점은 세포 노화 과정에서 생성되는 활성산소가 거대 미토콘드리아 형성에 중요한 역할을 할 가능성을 강하게 시사합니다. young HDF 세포 (PD 30)와 old HDF 세포 (PD 91)의 미토콘드리아 형태 비교를 통해 세포 노화 과정에서 거대 미토콘드리아 형성이 일반적인 현상임을 확인했습니다. 이러한 결과는 활성산소 증가가 세포 노화 과정에서 거대 미토콘드리아 형성을 유도하는 일반적인 현상임을 강력하게 지지합니다.

본 연구에서는 거대 미토콘드리아 형성 기전을 규명하기 위해 미토콘드리아 형태 조절에 관여하는 주요 단백질인 Drp1 (미토콘드리아 분열), Mfn1/2 (미토콘드리아 융합)의 발현량을 분석했습니다. DFO에 의해 유도된 세포 노화 모델에서, DFO 처리 1일차와 2일차에 Mfn2/Drp1의 발현 비율이 일시적으로 증가하는 현상이 관찰되었지만 Drp1의 발현량 자체는 변화가 없었습니다. 다른 세포 노화 모델(H₂O₂ 처리)에서도 유사한 결과가 나타났습니다. H₂O₂ (200μM) 4일 처리 시 Mfn1/Drp1과 Mfn2/Drp1 발현 비율이 현저하게 증가하였는데, 이는 Drp1 발현량 감소에 기인한 것으로 추정됩니다. EtBr 처리(미토콘드리아 DNA 손상) 모델에서는 Mfn1의 발현량만 2일차에 증가하였고, Drp1과 Mfn2는 변화가 없었습니다. old HDF 세포에서는 Mfn2/Drp1 발현 비율이 현저하게 증가했으며, 이는 Drp1 발현 감소와 Mfn2 발현 증가에 기인한 것으로 생각됩니다. 하지만 Mfn1은 young과 old HDF 세포 간에 발현량 차이가 없었습니다. 이러한 결과들은 미토콘드리아 융합/분열의 균형이 세포 노화 과정에서 Mfn 쪽으로 이동하며, 이것이 거대 미토콘드리아 형성과 밀접하게 관련되어 있음을 시사합니다.

거대 미토콘드리아 형성 기전을 더 자세히 탐구하기 위해, 미토콘드리아 분열 조절 단백질인 Drp1의 인산화 상태와 GSK3β와의 상호작용을 분석했습니다. DFO 처리 세포에서 Drp1의 크기가 감소하는 현상이 관찰되었는데, 이는 단순한 탈인산화 효소(λ-phosphatase)의 작용이 아닌, DFO에 의해 유도된 Drp1 관련 단백질 복합체의 구조적 변화로 인해 특정 protease의 접근성이 증가하여 Drp1이 분해(cleavage)되었기 때문으로 추정됩니다. Drp1의 인산화를 직접적으로 확인하기 위해 면역침전법을 통해 Drp1을 분리하고, 인산화된 serine, threonine, tyrosine 잔기를 검출하는 항체를 사용하여 Western blotting을 실시했습니다. 그 결과, Drp1의 serine과 threonine 잔기의 인산화가 DFO 처리에 따라 감소하는 경향을 보였습니다. glycogen 합성 조절에 관여하는 GSK3β의 인산화 상태를 조사한 결과, DFO 처리 후 GSK3β의 9번째 serine 잔기의 인산화가 증가했습니다. 이는 GSK3β의 불활성화를 의미하며, 결과적으로 glycogen synthase 활성화와 glycogen 축적을 초래할 가능성을 보여줍니다. 기존 연구에서 Drp1의 여러 isoform들이 GSK3β와 상호작용하고 GSK3β 활성에 의해 Drp1의 인산화가 조절될 수 있다는 보고가 있습니다. 본 연구 결과는 DFO에 의한 세포 노화 과정에서 GSK3β가 Drp1의 기능을 조절하는 가능성을 제시합니다.

세포 노화 모델에서 관찰된 거대 미토콘드리아 형성이 노화 과정에서 일반적인 현상인지 확인하기 위해, 정상적인 노화 과정에 있는 6, 12, 18, 24개월령의 Sprague-Dawley (SD) rat의 간 조직에서 미토콘드리아를 분리하여 Western blotting을 수행했습니다. 그 결과, 세포 노화 모델과 마찬가지로, 정상적인 노화 과정에서도 Mfn1과 Mfn2의 발현 비율이 Drp1에 비해 증가하는 경향을 보였습니다. 이는 Mfn/Drp1 발현 비율의 변화가 세포 노화 뿐 아니라 생체 노화에서도 거대 미토콘드리아 형성에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이러한 결과는 세포 노화와 생체 노화 모두에서 Mfn/Drp1의 발현 불균형에 의한 미토콘드리아 융합 증가가 거대 미토콘드리아 형성의 공통적인 기전임을 강력히 시사하며, 연구 결과의 일반화 가능성을 높입니다.

본 연구의 결과는 DFO 또는 H₂O₂에 의해 유도된 세포 노화 모델에서 관찰된 거대 미토콘드리아 형성이 활성산소(ROS) 생성 증가와 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 특히, 세포 노화를 유도하는 수준의 subcytotoxic 농도의 H₂O₂ 처리 시 거대 미토콘드리아 형성이 유도된 반면, 고농도 H₂O₂ 처리 시에는 미토콘드리아의 fragmentation과 세포 사멸이 관찰되었다는 사실은 활성산소의 양적 변화가 미토콘드리아 형태 변화에 중요한 영향을 미침을 시사합니다. 반면, Complex II 억제제인 TTFA 처리나 미토콘드리아 DNA 손상 유도(EtBr 처리, ρ0 세포)는 거대 미토콘드리아 형성과는 직접적인 연관성을 보이지 않았고, 오히려 미토콘드리아의 fragmentation을 야기하였습니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 세포 노화 과정에서 증가하는 활성산소가 거대 미토콘드리아 형성의 주요 매개 인자임을 강력하게 시사합니다. 이는 세포 노화와 미토콘드리아 기능 이상 사이의 연관성을 보다 명확하게 설명하는 중요한 발견입니다.

미토콘드리아의 형태는 미토콘드리아 융합(Mfn1/2)과 분열(Drp1)의 균형에 의해 조절됩니다. 본 연구에서는 다양한 세포 노화 모델에서 Mfn/Drp1의 발현 비율 변화를 분석하여 거대 미토콘드리아 형성 기전을 탐색했습니다. DFO, H₂O₂, 그리고 old HDF 세포에서 공통적으로 Mfn 단백질의 발현 증가 또는 Drp1 단백질 발현 감소로 인해 Mfn/Drp1 비율이 Mfn 쪽으로 이동하는 현상이 관찰되었습니다. 이는 미토콘드리아 융합 과정의 활성화를 의미하며, 이러한 융합 과정의 활성화가 거대 미토콘드리아 형성의 주요 원인 중 하나임을 제시합니다. Mfn1과 Mfn2의 knockout mouse에서 배 발생 치사 및 미토콘드리아 fragmentation이 보고된 사실은 Mfn 단백질이 미토콘드리아 융합에 필수적임을 보여주는 간접적인 증거입니다. 따라서, 본 연구 결과는 세포 노화 과정에서 활성산소 증가에 의해 유도되는 Mfn/Drp1 발현 불균형이 미토콘드리아 융합 과정의 증가를 통해 거대 미토콘드리아 형성을 촉진한다는 새로운 기전을 제시합니다.

본 연구에서는 endogenous Drp1의 인산화와 GSK3β와의 상호작용을 분석하여 Drp1 조절 기전에 대한 추가적인 단서를 제공했습니다. DFO 처리에 따른 Drp1의 크기 변화는 단순한 탈인산화에 의한 것이 아니며, 특정 protease에 의한 Drp1의 분해(cleavage)일 가능성이 제시됩니다. 또한, DFO 처리에 따른 GSK3β의 인산화 변화는 GSK3β가 Drp1의 기능 조절에 관여할 가능성을 시사합니다. 이러한 발견은 미토콘드리아 형태 조절에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공하고, 향후 연구를 위한 새로운 방향을 제시합니다. 본 연구에서 제시된 거대 미토콘드리아 형성 기전은 세포 노화 연구에 중요한 시사점을 제공하며, 미토콘드리아 기능 장애 및 관련 질병 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대됩니다. 특히, 활성산소 조절 및 미토콘드리아 형태 조절을 표적으로 하는 새로운 치료 전략 개발에 중요한 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 예상됩니다.