신경섬유종증 1형 종양세포 분자유전학적 분석 및 RNA 간섭치료법 개발

본 연구는 아주대학교 의과대학 부속병원에서 신경섬유종증 1형(NF1)으로 진단받고 수술받은 환자 1명의 조직 샘플을 사용했습니다. 정상 조직, 양성 종양 조직, 그리고 악성 종양 조직을 각각 분리하여 배양했습니다. 병리학적 검사를 통해 조직의 종류를 확인한 후, explant 방법을 이용하여 각 조직으로부터 primary 세포를 배양했습니다. 대조군 실험을 위해 한국세포주은행으로부터 N-Ras가 활성화된 HT-1080 세포주와 H-Ras가 활성화된 T24 세포주를 분양받아 배양하여 실험에 사용했습니다. 이렇게 얻어진 세포들을 이용하여 후속적인 세포 생물학적 특성 분석 및 분자 유전학적 분석을 진행했습니다. 세포 배양 과정에서 배지 종류 및 FBS 농도에 따른 세포 증식 차이를 비교 분석하여 최적의 배양 조건을 확립하고자 하였습니다. 이 과정에서 얻어진 결과는 후속 실험의 정확성과 효율성을 높이는 데 중요한 기반이 되었습니다. 세포 배양은 연구의 기본이 되는 중요한 과정이며, 정확한 세포 배양은 연구 결과의 신뢰성을 좌우하기 때문에 매우 신중하게 진행되었습니다. 다양한 배양 조건을 시험하여 최적의 조건을 찾아내는 노력이 세포 생물학적 분석의 정확도 향상에 기여했습니다.

배양된 정상, 양성, 악성 세포를 이용하여 염색체 분석을 위한 슬라이드를 제작하고 karyotyping을 수행했습니다. 각 슬라이드에서 총 20개의 metaphase 세포를 계수하여 분석했습니다. 분석 결과, 세 종류의 세포 모두에서 46, XY의 정상적인 염색체 수를 확인하였으며, 암에서 흔히 관찰되는 염색체 수적 이상이나 염색체 결실과 같은 이상은 발견되지 않았습니다. 이 결과는 이번 연구에 사용된 NF1 환자의 세포에서는 염색체 수준의 이상이 NF1 발병 및 악성화에 직접적으로 관여하지 않음을 시사합니다. 하지만 이는 단일 환자의 결과이며, 추가적인 연구를 통해 더 많은 환자 샘플을 분석하여 일반화 가능성을 확인할 필요가 있습니다. 염색체 분석은 세포의 유전적 안정성을 평가하는 중요한 단계이며, 정상적인 염색체 수는 세포의 기능과 성장에 필수적입니다. 본 연구에서 염색체 이상이 발견되지 않은 것은 NF1의 발병 기전을 이해하는 데 중요한 정보를 제공합니다. 후속 연구에서는 CGH array 등의 추가적인 분자유전학적 분석을 통해 좀 더 정밀한 염색체 이상 여부를 확인하는 것이 필요할 수 있습니다.

정상, 양성, 악성 세포에서의 주요 단백질 발현량을 비교 분석하기 위해 Western blotting을 수행했습니다. neurofibromin, p120RasGAP, 총 Ras, p-ERK 등 다양한 단백질에 대한 항체를 사용하여 단백질의 발현 양상과 활성화 정도를 분석했습니다. 그 결과, 악성 세포에서 정상 대립유전자의 neurofibromin 발현량이 현저히 감소되어 있음을 새롭게 확인했습니다. 또한, NF1 환자의 정상 세포에서 악성 세포로 갈수록 Ras 활성 조절 단백질인 p120RasGAP의 발현량이 감소하는 것을 발견했습니다. 이는 기존 연구에서 보고되지 않은 새로운 발견으로, NF1의 종양 형성 기전 이해에 중요한 단서를 제공합니다. ERK 단백질의 발현량은 세포 종류에 따른 차이가 없었지만, p-ERK 단백질은 악성 세포에서 활성화되어 있음을 확인했습니다. 사용된 항체는 Total Ras (Upstate Biotech), Neurofibromin (Abcam), p120RasGAP, N-Ras, K-Ras, H-Ras (Santa Cruz Biotechnology), ERK, phospho-ERK (Cell Signaling Technology) 등입니다. 이러한 결과들은 NF1의 발병 기전을 이해하고, 향후 치료 전략 개발에 중요한 정보를 제공합니다. 특히 p120RasGAP의 발현 감소는 새로운 치료 표적이 될 가능성을 제시합니다.

H-Ras의 활성화가 NF1 발병에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 H-Ras 유전자 (Exon 2, 3, 4, 5, 6)의 돌연변이 분석을 수행했습니다. 하지만, 다양한 암에서 흔히 발견되는 H-Ras 돌연변이는 발견되지 않았습니다. 또한, p120RasGAP를 암호화하는 Rasa1 유전자의 mutation hotspot (exon 1, 10, 11, 12, 17)에 대한 돌연변이 분석도 진행했지만, 돌연변이는 발견되지 않았습니다. p120RasGAP 단백질 발현량의 감소는 유전자 수준의 돌연변이가 아닌, 다른 조절 기전에 의한 것일 가능성이 높습니다. 이러한 결과는 NF1 발병에서 H-Ras 유전자의 돌연변이보다는 Ras 활성화를 조절하는 다른 기전, 예를 들어 p120RasGAP의 발현 조절 기전이 더 중요한 역할을 할 가능성을 시사합니다. 추가적인 연구를 통해 p120RasGAP 발현 조절 기전에 대한 이해를 높이는 것이 NF1 치료 전략 개발에 도움이 될 것입니다. 본 연구에서 사용된 분석 방법은 PCR 기반의 sequencing 방법이며, Alabama 대학교 Birmingham의 의학유전학 실험실에서 수행되었습니다.

H-Ras 단백질의 과잉 활성화를 억제하기 위해 RNA 간섭(RNAi) 기법을 이용한 연구를 진행했습니다. 먼저, U6 promoter를 포함하는 shRNA construct를 제작하기 위해 human gDNA를 template로 하여 PCR을 수행했습니다. 사용된 primer는 hU6-fw: 5'-CAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3' 와 hU6-rv: 5'-CACGGTGTTTCGTCC TTTCCACAAG-3' 입니다. PCR 산물은 Promega사의 pGEM-T easy vector를 이용하여 subcloning 했습니다. Invitrogen Corp.의 T4 DNA ligase를 사용하여 ligation을 진행하고, E.coli DH5α competent cell에 transformation 시킨 후, X-gal과 ampicillin이 포함된 LB 배지에서 colony를 형성시켰습니다. white colony를 선택하여 M13 primer를 이용한 colony PCR을 수행하고, DNA mini preparation과 sequencing을 통해 원하는 DNA 클론을 확보했습니다. 총 8개의 RNAi construct를 제작하여 실험에 사용했습니다. 이러한 과정을 통해 H-Ras의 발현을 특이적으로 감소시킬 수 있는 RNAi construct 제작을 위한 cloning 과정이 성공적으로 완료되었습니다. 이 과정은 RNAi 기법을 이용한 H-Ras 활성 억제 연구의 기본 단계이며, 정확한 cloning은 연구 결과의 신뢰성을 확보하는 데 매우 중요합니다.

제작된 shRNA construct를 H-Ras가 활성화된 세포주(T24)와 NF1 환자로부터 분리한 정상, 양성, 악성 세포에 transfection 하였습니다. primary cell의 transfection 효율이 낮기 때문에, 다양한 transfection reagent를 사용하여 효율을 비교하였습니다. H-Ras가 이미 활성화되어 있는 T24 세포주는 Lipofectamine-LTX (Invitrogen Corp.)를 이용하여 transfection을 진행했습니다. transfection 12시간 후, 75 µg/ml hygromycin B (A.G. Scientific)를 포함하는 배지로 교체하여 stable cell line을 확립했습니다. 36시간 후에는 20 µg/ml hygromycin이 포함된 배지로 교체하며 계대 배양을 진행했습니다. NF1 환자 유래 세포에는 electroporation (microporator) 기법을 이용하여 shRNA construct를 도입했습니다. 이를 통해 세포주와 NF1 환자 유래 세포 모두에서 H-Ras 발현 억제 효과를 평가할 수 있었습니다. primary cell의 transfection 효율을 높이기 위한 최적의 방법을 찾는 것은 연구의 성공적인 수행을 위해 매우 중요한 과정이었습니다.

transfection 후 Western blotting을 통해 H-Ras 단백질 발현량의 변화를 분석했습니다. H-Ras 발현 감소 효과가 확인된 3개의 shRNA construct (H-#1, H-#2, H-2#1)를 선별했습니다. 세포주(T24)에서는 H-#1, H-#2, H-2#1 모두에서 H-Ras 단백질 발현 감소가 확인되었지만, NF1 환자 유래 세포에서는 세포주에서와 같은 정도의 감소 효과는 관찰되지 않았습니다. 특히, H-#1은 NF1 환자의 정상, 양성, 악성 세포에서 모두 H-Ras 단백질 발현 감소를 보였지만, 감소 정도는 세포주에서보다 훨씬 미약했습니다. H-#2는 정상 및 양성 세포에서만 H-Ras 단백질 발현 감소 효과가 나타났으며, 악성 세포에서는 효과가 없었습니다. H-2#1은 정상 및 양성 세포에서 현저한 H-Ras 단백질 발현 감소를 보였고, 악성 세포에서도 일부 감소 효과를 보였습니다. 현재는 이들 RNAi construct 도입 시 세포 증식 속도 변화, 세포 형태 변화, 세포 독성 등에 대한 추가 분석을 진행하고 있습니다. 이러한 결과는 향후 NF1 치료 전략 개발에 있어서 RNAi 기법의 적용 가능성과 한계를 동시에 보여줍니다.

본 연구의 주요 결과는 NF1 환자 유래 세포에서의 neurofibromin과 p120RasGAP 단백질 발현 감소, 그리고 H-Ras의 특이적 활성화를 확인한 것입니다. 특히 악성 세포에서는 정상 대립유전자의 neurofibromin 발현이 현저히 감소하였고, 정상세포에서 악성세포로 갈수록 p120RasGAP 발현량도 감소하는 새로운 사실을 발견했습니다. 이러한 결과는 기존 연구에서는 보고되지 않았던 새로운 발견으로, NF1의 종양 형성 기전 이해에 크게 기여할 것으로 기대됩니다. 또한, H-Ras 유전자와 Rasa1 유전자 (p120RasGAP 암호화 유전자)의 mutation hotspot에 대한 분석에서는 돌연변이가 발견되지 않았습니다. 이는 p120RasGAP의 발현 감소가 유전적 돌연변이보다는 다른 조절 기전에 의한 것임을 시사합니다. 이러한 발견들은 NF1의 발병 기전에 대한 이해를 넓히고, 새로운 치료 표적을 제시하는 데 중요한 의미를 갖습니다. 특히 p120RasGAP의 발현 조절 기전에 대한 추가 연구가 필요합니다.

H-Ras 활성 억제를 위해 RNA 간섭(RNAi) 기법을 적용한 결과, 세포주(T24)에서는 shRNA construct를 이용하여 H-Ras 발현을 효과적으로 억제할 수 있었습니다. 하지만 NF1 환자 유래 세포에서는 세포주에서와 같은 정도의 억제 효과는 나타나지 않았습니다. 이는 primary cell의 transfection 효율이 낮고, 세포 특이적인 요인이 H-Ras 억제 효과에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 본 연구에서는 electroporation을 통해 transfection 효율을 높이고자 노력했지만, 세포주와 환자 유래 세포 간의 차이를 완전히 극복하지는 못했습니다. 따라서 향후 연구에서는 primary cell에서의 RNAi 효율을 더욱 높이기 위한 최적화된 전달 시스템 개발이 중요합니다. 또한, RNAi construct의 장기간 효과 및 세포 독성 등에 대한 추가 연구가 필요합니다. pREP4 벡터를 사용하여 장기간 효과를 관찰할 수 있는 시스템을 구축하였으나, 더욱 효과적인 RNAi 전달 시스템 개발이 필요한 것으로 판단됩니다.

본 연구 결과를 바탕으로, 향후 연구는 다음과 같은 방향으로 진행되어야 합니다. 첫째, p120RasGAP 단백질의 발현 조절 기전에 대한 심층적인 연구가 필요합니다. p120RasGAP 발현 감소가 NF1 악성화에 미치는 영향과 그 작용 기전을 규명하는 연구가 중요합니다. 둘째, NF1 환자 유래 세포에서 RNAi 효율을 증가시키기 위한 최적화된 전달 시스템 개발이 필요합니다. 이는 더욱 효과적인 NF1 치료법 개발을 위해 필수적인 과정입니다. 셋째, 개발된 RNAi construct의 장기간 효과 및 세포 독성에 대한 추가적인 연구를 통해 안전성 및 효능을 검증해야 합니다. 넷째, 다양한 NF1 환자 샘플을 이용한 추가 연구를 통해 본 연구 결과의 일반화 가능성을 확인해야 합니다. 본 연구는 NF1의 발병 기전과 치료 전략 개발에 대한 중요한 기초 자료를 제공하지만, 추가적인 연구를 통해 더욱 깊이 있는 이해와 효과적인 치료법 개발을 위한 노력을 지속해야 합니다. 특히, p120RasGAP 단백질과 H-Ras를 동시에 타겟팅하는 치료 전략에 대한 연구가 필요합니다.